检测方法的试剂、仪器和耗材、操作过程、成果断定、试验室生物安全等技能要求。
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DNA提取试剂的制造见附录A，或选取商品化的病毒DNA提取试剂盒并参照说明书进行DNA提取。
3.3.1选用针对非洲猪瘟病毒VP72基因（核苷酸序列见附录B）的引物及探针：
3.3.3运用国家农业行政主任部分同意的其他引物、探针，应对检测程序和断定规范作相应调整。
分析天平（感量0.1mg）、高速台式冷冻离心机（最高离心速度不低于12 000r/min）、冰盒、实时荧光PCR仪及配套反响管（板）、安排研磨器、-20℃冰箱、可调移液器（2μL，20μL，200μL，1 000μL）、1.5mL离心管（无核酸酶）。
样品搜集及运送依照NY/T541的规则履行，搜集猪的脾脏、淋巴结、血液等安排资料或血粉用于检测，样品应在冷藏条件下赶快运送至试验室，防止重复冻融。采样时应穿戴个人生物安全防护配备，施行现场消毒和抛弃物处理。
检测前样品应在二级生物安全柜中处理。取0.1g～0.2g安排或血粉，经研磨破碎后加1mL的0.01mol/L PBS（pH7.2）制成匀浆，经12 000 r/min离心2Min取上清；全血、血清样品直接取1mL，置于1.5 mL离心管内盖紧管帽。将上述处理的样品置于60℃条件下灭活30min。
搜集或处理好的样品在2℃～8℃条件下保存应不超越24 h；如需长时间保存，应放置-70℃冰箱，但应防止重复冻融（冻融不超越3次）。
5.4.1 DNA提取应在样本制备区内选用以下方法来进行，若运用其他等效的病毒DNA提取试剂，则依照试剂说明书操作。
5.4.2待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用n表明，取n个灭菌1.5 mL离心管，逐管编号。
5.4.3每管参加200μL DNA提取液1，然后别离参加待测样品、阴性对照和阳性对照各200μL，1份样品换用1个吸头，混匀器上震动混匀5s。于4℃～25℃条件下，13 000 r/min离心10 min。DNA提取液1见附录A。
5.4.4尽可能汲取上清、弃去，吸头不要碰到沉积，再参加10μL DNA提取液2，混匀器上震动混匀5 s。于4℃～25℃条件下，2 000 r/min离心10s。DNA提取液2见附录A。
5.4.6参加90μL无DNA酶的灭菌去离子水，13 000 r/min离心10 min，上清即为提取的DNA，-20℃保存备用。无DNA酶的灭菌去离子水见附录A。
5.5.1在反响混合物制造区、样品制备区和检测区别离进行5.5.2～5.5.4。
5.5.2每个检测反响系统需运用20μL实时荧光PCR反响液。依据5.4.2中设定的n值，按附录D制造反响液，充沛混匀后分装，每个PCR反响管20μL。搬运PCR反响管至样品制备区。
5.5.3在上述5.5.2的反响管中别离参加5.4中提取的DNA溶液5μL，使每管总体积抵达25μL，记载反响管对应的样品编号。盖紧管盖后，瞬时离心。
5.5.4将5.5.3加样后的反响管放入实时荧光PCR检测仪内，记载反响管摆放次序。选定5-羧基荧光素（FAM）作为陈述基团，小沟结合物（MGB）为淬灭基团，反响参数设置如下：预变性95℃/3 min；95℃/15 s，52℃/10 s，60℃/35 s，45个循环；在每次循环的60℃退火延伸时搜集荧光。试验完毕后，依据搜集的Ct值和荧光曲线、成果断定
检测阈值设定准则：阈值线超越阴性对照扩增曲线的最高点，且相交于阳性对照扩增曲线进入指数增长时间的拐点，或依据仪器噪声状况做调整。每个样品反响管内的荧光信号抵达设定的域值时所阅历的循环数即为
且呈现典型扩增曲线，阴性对照无Ct值无扩增曲线时，试验建立，实例参阅附录E。当被检样品呈现典型的扩增曲线时，判为非洲猪瘟病毒核酸阳性；被检样品无Ct值，判为非洲猪瘟病毒核酸阴性；关于Ct值＞38.0的样品且呈现典型的扩增曲线，应重检，重检仍呈现上述成果的判为阳性，不然判为阴性。7、试验室生物安全要求
7.2运用过的试验器件和液体抛弃物应先通过消毒液浸泡处理，再经高温度高压力处理后抛弃。剩下样品等固体抛弃物应在生物安全柜中密封包装，经外表消毒后移出，再经高温度高压力处理后抛弃。
36 mL，加NaCl 8.5 g，用蒸馏水定容至1 000 mL。通过滤除菌后，无菌条件下分装。A.6无DNA酶的灭菌去离子水
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